福尔马林固定石蜡包埋组织中代谢物的高分辨率空间代谢组学

代谢物是反映代谢途径的小分子（<1,500 Da）化合物，能揭示基因表达、蛋白质功能、环境因素和疾病状态之间的相互作用。代谢研究通常使用冷冻组织，但大多数组织样本是通过福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）保存的。大多数研究者认为经过FFPE处理过的组织，其代谢物会发生改变或者丢失，因此对于存档组织样本的代谢评估未引起重视。

德国Axel Walch 团队研究发现与新鲜冷冻样品比较，FFPE 样品中检测到质量范围 m/z 50–1000 内约 1500 个 分子，还保留有m/z 种类的72%，这表明代谢物在 FFPE 组织样品中在很大程度上是保留的。该研究成果“High-mass-resolution MALDI mass spectrometry imaging of metabolites from formalin-fixed paraffin-embedded tissue”发表在Nature Protocol上。今天我们根据这篇文章分享FFPE样本的空间代谢组学分析的全部流程及详细步骤。

背景介绍

福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织样本的制备过程：首先，将组织样品浸泡在福尔马林溶液中进行固定。接着，通过将样品逐步浸入不同浓度的乙醇中以去除固定剂和水分，然后用有机溶剂（如二甲苯）替换乙醇。最后，将处理后的样品浸入熔融的石蜡中进行包埋。福尔马林通过在组织蛋白质之间形成亚甲基交叉桥来固定组织，而石蜡包埋则能在室温下长时间保存组织。FFPE 组织样本适用于高分辨率基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换离子回旋共振质谱成像 （MALDI-Ft-Icr-MSI）的分析，包括活检样本、手术切除样本以及组织微阵列（TMA），如Fig1所示。

Fig 1. MALDI-MSI 代谢物成像的 FFPE 组织样本的主要类型。

工作流程

该实验整体的流程主要包括三个步骤，样本制备，质谱分析和数据分析。如Fig2所示。

Fig 2. MALDI MSI基本流程。

l      样本制备：将FFPE组织切成4µm厚度，固定于涂有聚-L-赖氨酸（提高粘附力）的ITO导电玻片上，然后将组织浸泡在有机溶剂中（二甲苯）进行脱蜡，再进行基质（9-氨基吖啶盐酸盐一水合物）喷涂，可以辅助代谢物的解吸和电离。

l       MSI分析：在负离子模式下，选择分辨率为50µm，m/z 为50–1000 的质量范围，使用激光对组织切片进行二维（x、y 轴）光栅扫描，成像后，使用 70% 乙醇去除基质后，进行 HE 染色，将染色后的组织学图像与质谱图像进行精确配对。

l       数据分析：质谱数据进行分析与HMDB,KEGG和METLIN等数据库对比鉴定代谢物；进行聚类分析和代谢通路分析。

方法应用

FFPE组织切片中的代谢物具有化学保存性，重复性和高空间分辨率，这种方法可用于检查许多不同类型组织中疾病的代谢物分布。Fig3展示了代谢物的保存性，在分辨率为60µm下，比较新鲜冷冻组织样本与多病人 FFPE 组织芯片（TMA）中结肠癌代谢物分布情况。

Fig 3. 结肠癌新鲜冷冻组织样本与多病人 FFPE TMA中代谢物分布比较

经过MSI分析和HE染色图像进行匹配后，发现新鲜冷冻结肠癌组织样本中的半乳糖-1-磷酸（m/z 259.0140；绿色）的分布在 FFPE TMA 中的粘液也同样表达。 新鲜冷冻结肠癌患者组织样本和 FFPE TMA 中的肿瘤细胞密集区域高表达6-磷酸己糖（m/z 259.0230；红色），而N-乙酰氨基葡萄糖硫酸盐（m/z 300.0400；黄色）位于细胞外基质。此实验所检测的代谢物分布情况，揭示此成像方法的对于FFPE TMA中的代谢物比新鲜样本更具有空间特异性（Fig 3）。

  此外，该团队通过不同日期检测3个连续TMA切片，以检验该方法的重复性（Fig 4）。Fig 4a展示不同日期检测乳腺癌3个连续TMA切片中的特定m/z，发现其具有相似的强度和分布情况。4b热图展示了五种乳腺癌患者样本的重复性。

Fig 4. MALDI-MSI 方法分析 FFPE 代谢物的重复性。

 此外，该方法可以对小的穿刺样本进行检测，Fig 5展示肝穿刺活检组织的测定结果。虽然组织较小，但仍可以检测到各种代谢物，并展示了这些代谢物的分布情况。

Fig 5. 肝硬化肝活检中代谢物的 MSI。(a) 使用小样本组织学定位技术测量小样本中不同类别的代谢物时，可检测出不同的组织学定位。 (b）高倍放大图像显示，纤维化区域（m/z 300.0400）和剩余肝实质肝细胞区域（m/z 408.0106）的特定 m/z 值保持不变。

  除了可以检测各种代谢物在组织上的表达情况之外，还可以对这些数据进行分析，解决临床相关的问题，例如预测患者的预后，Fig 6展示了食管腺癌患者利用质谱数据进行患者预后分层，并通过预测患者生存状态探索新的肿瘤预后标记物。

Fig 6. 代谢物 MSI 数据分析确定了生存状态和一种新的独立癌症预后标志物。a，食管腺癌患者根据MSI数据进行聚类分析。b, 以硫酸酯化脱氧糖酸（m/z 256.9975）为预后因子进行患者生存分析及其分子分布展示。

技术优缺点

优点

l 实现FFPE样本的代谢物检测。

l 样本利于保存，处理简单，重复性好，特异性高，可实现高通量。

l 通过组织学图像和MSI图像的精准匹配，实现代谢物的组织空间分布分析。

缺点

l FFPE样本会丢失脂质分子。

l 只能检测代谢物的相对定量，对于鉴定代谢物还需要液相质谱验证。

l MALDI-MSI的空间分辨率未达到细胞水平

l 数据量大，对于电脑软硬件要求高。

该方法创造性的开发了FFPE样本的代谢物检测，并且证明其具有化学保存性好，重复性高和高空间分辨率，而且对于FFPE样本的代谢含量不受组织样本保存年限的影响。通过该方法可以检测样本的特定代谢物，并探索疾病诊断和预后的新标志物。

参考文献

[1]        LY A, BUCK A, BALLUFF B, et al. High-mass-resolution MALDI mass spectrometry imaging of metabolites from formalin-fixed paraffin-embedded tissue [J]. Nature Protocols, 2016, 11，1428.

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